Я занимаюсь синтетической биологией около полутора лет. Когда я только начинал, я обнаружил, что прямые трансляции Чей это ген? очень помогают мне освоиться. Я решил превратить первую половину первого потока в учебник по использованию GIL для разработки генетических модификаций.

Примечание: если вы уже знакомы с основами синтетической биологии, вам следует сразу перейти к части 2

Часть 1: Плазмида

Почти все микробные генетические модификации используют кольцо ДНК, называемое плазмидой, для доставки генов. Плазмида обычно состоит из трех частей: ORI, маркера селекции и (иногда) промотора для вашей модификации.

Ориджин репликации (ORI) — это особая последовательность ДНК, которая сообщает клетке-хозяину копировать плазмиду. Без этого плазмида исчезла бы уже через пару клеточных делений. Большинство плазмид имеют 2 ORI; один ORI позволяет репликацию в E.Coli, а другой позволяет репликацию в организме-мишени. Это позволяет вам сделать несколько копий плазмиды в E.Coli, прежде чем переносить ее в более сложный или медленно растущий организм.

Маркер селекции, вероятно, является наиболее важной частью плазмиды. Когда мы втыкаем плазмиду в колонию микробов, мы не получим одинаковое количество плазмиды во всех из них. Маркеры селекции позволяют нам убивать все клетки, которые не получили плазмиду, и заставляют наши микробы продолжать делать то, что мы от них хотим. Например, в этом руководстве используется маркер устойчивости к антибиотикам. Если вы выращиваете бактерии на чашках с добавлением этого антибиотика, выживут только те бактерии, у которых есть наша плазмида.

Наконец, многие плазмиды имеют промотор. Промотор — это кусочек ДНК, похожий на маленький флажок, который сообщает клетке, что здесь есть ген, который она должна создать. Без промотора клетка просто проигнорирует наши модификации.

В этом уроке мы будем использовать плазмиду Addgene p46815 (та, что использовалась в оригинальной прямой трансляции). Я уже написал GIL-версию этой плазмиды, скачайте ее из репозитория GitHub здесь.

Часть 2. Настройка среды CadBerry/GIL

Для компиляции этого проекта вам понадобятся две вещи. Сначала перейдите в репозиторий CadBerry GitHub и загрузите последний выпуск 0.1. Если вы используете Windows, вы можете просто запустить программу установки, и она установит CadBerry в вашей системе. Если вы используете Linux, все будет немного сложнее. Хотя CadBerry поддерживает Linux, у нас пока нет пакетов. CadBerry придется компилировать самостоятельно, следуя инструкциям в репозитории (Contributing.md, вам придется немного их модифицировать для Linux)

После того, как вы загрузили CadBerry, вам нужно будет установить VSCode, чтобы вы могли редактировать файлы GIL. Чтобы убедиться, что у вас есть VSCode, введите code в консоли. Если откроется окно VSCode, ваша установка VSCode будет доступна для CadBerry.

Далее нам нужно создать проект CadBerry. Запустите Berry.exe и нажмите «Новый проект», и вы должны увидеть что-то вроде скриншота ниже, только без существующих проектов.

Введите имя проекта, который вы хотите создать (я называю его «Учебник»), нажмите «Выбрать путь к проекту», выберите папку с файлом плазмида GIL и нажмите «Создать проект!». На этом этапе ваш экран должен выглядеть следующим образом:

Не обращайте внимания на пакеты, работа над ними еще не завершена. Если вы перейдете в Windows -> Редактор кода, CadBerry откроет окно VSCode, которое вы можете использовать для редактирования файлов GIL.

Примечание: если вам нужна хорошая подсветка синтаксиса для файлов GIL, вы можете получить расширение подсветки синтаксиса GIL здесь.

Часть 3: Внесение изменений

Мы собираемся использовать два белка, чтобы заставить дрожжи производить яичные белки. Сами яичные белки в основном состоят из овальбумина. Если бы мы просто производили овальбумин в клетках дрожжей, он накапливался бы до тех пор, пока не убил бы клетки. Из-за этого мы должны добавить немного белка под названием альфа-фактор спаривания к началу овальбумина. Этот пептид заставляет дрожжи высвобождать овальбумин в раствор, в котором они растут.

Прежде всего, нам нужно установить наш целевой организм. Добавьте #Target “Yeast” или #Target “S.Cerevisiae” в начало нового файла с именем Eggs.gil.

Далее нам нужно импортировать файл GIL, содержащий плазмиду. Добавьте строку import “Plasmid” в файл.

Теперь пришло время определить последовательности, которые мы будем использовать. AlphaMatingFactor будет содержать один литерал ДНК, который кодирует пептид Alpha Mating Factor. Chicken_Ovalbumin будет аминокислотной последовательностью, которая кодирует куриную версию белка Ovalbumin. Компилятор автоматически преобразует эту аминокислотную последовательность в ДНК, оптимизированную для дрожжей. Ниже приведен код этих последовательностей:

sequence AlphaMatingFactor
{
    'atgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagct'
}
sequence Chicken_Ovalbumin
{
    @MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRF
    DKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQ
    CVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIV
    FKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTM
    SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMA
    MGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFR
    ADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP@
}

Примечание: если вы хотите оптимизировать аминокислотную последовательность для организма, отличного от вашего целевого организма, используйте for “NewOrganism” { Amino acids here }

Наконец, нам нужно собрать все воедино. Вызовите операцию Plasmid::plasmid для AlphaMatingFactor и Chicken_Ovalbumin. На этом этапе ваш файл должен выглядеть так:

На этом мы закончили! Нам просто нужно скомпилировать файл. Заходим в Проект -> Настройки и убираем галочку с опции «Создать точку входа». Теперь нажмите Project -> Build. Ваше меню сборки должно выглядеть так:

В качестве точки входа введите «Яйца» (не беспокойтесь о «.gil»). Для выходного каталога скопируйте путь к любой папке, в которую вы хотите, чтобы CadBerry поместил скомпилированные файлы GIL. Наконец, добавьте «FullBuild» в качестве активного дистрибутива. Это укажет GIL скомпилировать всю плазмиду, а не только вашу модификацию. Ваш экран должен выглядеть примерно так:

Нажмите «Создать проект!» и CadBerry скомпилирует все файлы GIL в файлы GenBank, которые вы сможете импортировать в средство просмотра плазмид, такое как Benchling. Ниже скриншот готовой плазмиды:

В этом руководстве лишь поверхностно показаны возможности GIL, поэтому, если вам интересно, я настоятельно рекомендую ознакомиться с файлом примеров GIL. Каждая версия GIL проверяется на это, поэтому содержимое этого файла гарантированно является самой последней версией GIL.

Привет 👋

Я очень ценю, что вы дочитали мою статью до конца. Если GIL вам интересен, я настоятельно рекомендую вам проверить его. Если вы хотите быть в курсе о GIL и других вещах, над которыми я работаю, подпишитесь на мою рассылку и следуйте за мной в Twitter.